醛基活化瓊脂糖基質在制備和使用定制親和色譜填料方面具有良好的記錄。將生物特異性配體與醛基活化瓊脂糖偶聯是一項成功且有據可查的技術。

醛基活化瓊脂糖色譜填料(Aldehyde-activated SepFast)通過還原胺化反應與含有伯胺基團的配體形成化學穩(wěn)定的仲胺鍵。這種預活化的瓊脂糖基質可用于親和色譜填料的定制，適用于小規(guī)模和大規(guī)模純化應用。

1. 屬性

有2種基質可供選擇，適合各種待偶聯或純化的分子。

• 醛基活化瓊脂糖色譜填料(Aldehyde-activated SepFast 4 High Flow)由高度交聯的4%珠狀瓊脂糖組成。其大孔徑適用于偶聯或純化大分子。它具有高機械剛度，可在降低背壓的情況下實現高流量。

• 醛基活化瓊脂糖色譜填料(Aldehyde-activated SepFast 6 High Flow)由高度交聯的6%珠狀瓊脂糖組成。其適中的孔徑適用于偶聯較小的分子。它也具有高機械剛度，可在降低背壓的情況下實現高流量。

由于瓊脂糖具有出色的親水性和低非特異性結合特性，長期以來一直用于色譜分離。這些顆粒具有開孔結構，對各種分子具有出色的傳質性能。基質通過氧化被激活以產生醛基，它直接與分子中的伯胺基反應，在還原劑存在的情況下被固定化。

醛基活化瓊脂糖色譜填料(Aldehyde-activated SepFast)以20%乙醇中的水懸浮液形式提供。

表1  醛基活化瓊脂糖色譜填料(Aldehyde-activated SepFast)的特性

2. 配體固定化

以下是一般的配體偶聯程序。

2.1  將目標配體溶解在偶聯緩沖液中，0.1 M磷酸鈉，pH 7.0。一般對于蛋白質配體，凝膠的制備濃度為5 - 20 mg/ml。對于小配體，凝膠的制備濃度為10 - 100  µmol/ml。偶聯緩沖液的體積可以是固定凝膠體積的一半或相同。

2.2  在過濾裝置中用至少5 倍體積的偶聯緩沖液清洗醛活化凝膠。

2.3  將洗凈并吸干的凝膠（來自步驟  2.2）轉移到步驟  2.1 制備的溶液中。

如果發(fā)生變化，請調整 pH 值。

2.4  將漿液在通風良好的通風櫥中在室溫下混合 2?4 小時。

2.5  將氰基硼QING化鈉（0.5 g/100 ml  活性凝膠）加入漿液中，過夜。注意：氰基硼qing化鈉有毒，應格外小心處理。

2.6  用至少 5 倍凝膠體積的偶聯緩沖液清洗凝膠。

2.7 在氰基硼QING化鈉存在下，將凝膠重新懸浮到相同體積的封閉溶液，0.1 M Tris/HCl，pH 8.0或1 M乙醇胺，pH 8.0中2-3小時。

2.8 用5倍體積的0.1 M Tris/HCl + 1 M NaCl，pH 8.0 洗滌凝膠，然后用5倍體積的0.1 M醋酸鹽緩沖液 + 1 M NaCl，pH 4.0洗滌凝膠。

2.9 使用前用工作/平衡緩沖液清洗凝膠。

3. 固定化效率的一般考慮

3.1 pH

還原胺化可以在pH 4 - 10之間非常有效地進行。但是可以優(yōu)化偶聯pH以獲得最佳結果（例如，高偶聯產率和高配體活性）。

在配體溶解后要注意調整偶聯 pH 值。

3.2 偶聯方案

應避免使用含有氨基的溶液。

可以引入稀釋的某些有機溶劑以提高配體的溶解度。應事先測試此類溶劑的適用性。

耦合溶液的體積與活化凝膠的體積保持一致。建議使用0.5-1 : 1 v/v的理想比例。

3.3 鹽

偶聯緩沖液中鹽的存在（例如0.5  M 或飽和）可以提高固定效率。

3.4 基礎基質中的活化基團

對于某些配體或應用，基礎基質中的活化水平可能過高，偶聯配體的活性可能會降低。

在降低的 pH 值下偶聯可能會減少配體分子的連接點。它可以提高偶聯配體的活性。活化基團的受控封閉，例如在添加配體前幾個小時用  5?10  mM  封閉緩沖液孵育凝膠，也可以減少過度偶聯問題。

3.5 反應時間

可以優(yōu)化偶聯過程中配體和活化填料之間的接觸時間以保持配體的生物活性。

3.6 還原劑的選擇

其他還原劑如硼QING化鈉可用于偶聯反應。氰基硼氫化物是一種較溫和的還原劑，它只還原醛基和伯胺基之間形成的中間席夫堿，得到穩(wěn)定的仲胺鍵。硼氫化物是一種更強的還原劑，可還原席夫堿和未偶聯的醛基。

3.7 屏蔽剩余的活化配體

未與配體反應的活化基團應通過添加含有pH 8 - 9伯胺的額外小分子（例如 Tris 或乙醇胺）來封端。

3.8 最終填料的洗滌

偶聯反應后需要將未連接或弱連接的配體WAN全洗掉。采用高pH值和低pH值交替的洗滌方法可以確保有效去除不需要的物質。

4. 固定化親和填料的使用

配體偶聯填料可用于使用間歇攪拌罐模式或填充柱模式的純化。處理這種材料遵循與處理其他基于瓊脂糖基質相同的原則。

5. 儲存

醛基活化瓊脂糖色譜填料(Aldehyde-activated SepFast)t應在8℃下儲存。偶聯的濕填料應在防菌劑（例如20%乙醇）存在的情況下于4-8℃儲存。切勿凍存耦合填料。

6. 更多信息

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